《刺客信条:兄弟会》紧接前作《刺客信条II》 ，酒保Desmond Miles与其余三名现代刺客（Lucy Stillman, Shuan Hastings, Rebecca Crane）在逃离跨国制药公司Abstergo（现代圣殿骑士团）的追击后到达意大利城市蒙特里久尼。以已荒废的Auditore庄园地下室作为新的藏身之所，Desmond再次使用基因记忆追溯机器“Animus 2.0”，再度进入其刺客祖先Ezio Auditore de Firenze的记忆。
1499年12月文艺复兴时期，40岁的Ezio于放弃刺杀教宗亚历山大六世Rodrigo Borgia（圣殿骑士团之首）后回到蒙特里久尼。1500年1月，教宗之子凯萨·波吉耳一天晚上领兵对城市发动攻击。凯萨于城破之时夺回Ezio伯父Mario Auditore保管之古代遗物“伊甸碎片”、将之枪杀及命士兵枪伤Ezio。Ezio负伤带领佣兵及家人逃走后独自前往意大利首都罗马，并发现波吉耳家族已几乎完全控制了整个罗马市，市区百业萧条，市民被剥削而生活困苦。以市内台伯河上的小岛台伯岛为基地，Ezio联结市内妓女、盗贼及佣兵势力，以及招揽反抗的市民加入其刺客兄弟会以解放在教宗势力控制下的罗马。于各方协助下，Ezio得知凯萨的财政由其兄长胡安·波古耳负责，而凯萨则欲借助法国瓦卢瓦公爵路易十二的军事力量以及发明家达芬奇之战争机器以征服意大利。
在把凯萨的财源和军队瓦解以及把达芬奇的战争机器毁灭后，Ezio于1503年潜进梵蒂冈圣天使城堡欲与教宗对质时得知“伊甸碎片”已落入教宗手上，而教宗因不满其子无穷的野心（包括对蒙特里久尼发动攻击）而对凯萨下毒。凯萨得知后把教宗杀死并到圣彼得大教堂夺回碎片但被Ezio先行夺得。同年12月教宗儒略二世即位并下令拘捕凯萨。1507年3月Ezio前往西班牙维亚纳并于围城战中与凯萨进行最后决斗，Ezio把凯萨击败后将其从城墙投下，最后把碎片藏在罗马斗兽场附近一密室内。
Desmond等四人于猜出密室密码后前往正进行工程的斗兽场，并从地下通道进入天坛圣母堂。在启动教堂内机关后Desmond四人成功进入位于教堂地底之朱诺神殿（也是碎片所在地），但在Desmond触及碎片一刻，被称为朱诺（Juno）的立体影像（与《刺客信条II》之弥涅耳瓦（Minerva）同属人类以前的外太空文明种族）控制了其身体使其对Lucy腹部刺了一刀。
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